DIRECT AND INDIRECT COOMB'S TEST

ANTIGLUBULIN TEST

1945 Mourant, Coombs & Race ® pemeriksaan untuk mendeteksi Ab yang tidak mengaglutinasi / Ab yang menyelimuti sdm dalam serum.

Pemeriksaan yang sama dipergunakan untuk memperlihatkan coated cells (penyelubungan sdm) invivo dengan Ab & Kompls ® dinamakan antiglobulin test.
Antiglobulin test 2 macam, yaitu :
1. Direct antiglobulin test (DAT)
2. Indirect antiglobulin test (IAT)

DAT ® untuk mendeteksi Ab / komplemen yang menyelimuti seldm invivo, misal auto immune hemolytic anemia (AIHA), drug induced hemolytic disease of the newborn (HDN), allo immune reaction karena reaksi transfusi.

IAT ® untuk mendeteksi reaksi antara sdm & coating Ab, misal deteksi Ab, identify Ab, golongan darah, uji cocok serasi.

Prinsip Antiglobulin Test

Antiglobulin test didasarkan pada prinsip sebagai berikut :
1. Molekul Ab & komplemen termasuk golongan globulin.
2. Globulin asal manusia disuntikkan pada binatang ® menstimulasi binatang ® Ab terhadap protein asing ® globulin manusia Ab yang terbentuk ® Anti human globulin (AHG).
Serum binatang diadsorbsi untuk menyingkirkan Ab lain yang tidak diinginkan ® bereaksi spesifik dengan human globulin.
3. AHG bereaksi dengan molekul globulin manusia baik yang berikatan pada adm / yang bebas dalam serum / plasma.
Globulin yang bebas dalam serum / plasma bereaksi dan menetralisir AHG yang ditambahkan kedalam tabung pemeriksaan yang mengandung sdm yang diselubungi oleh molekul globulin bebas. Globulin bebas dapat menetralisir AHG dan mengakibatkan hasil ® neg palsu, kec bila sdm dicuci sampai tidak mengandung globulin bebas lagi.
4. Sdm yang telah dicuci dan yang diselubungi oleh globulin manusia akan diaglutinasi oleh AHG. Fab portion molekul AHG bereaksi dengan Fc portion dari 2 molekul Ab yang menyelubungi 2 sdm yang terpisah. Sdm yang tidak diselubungi tidak akan diaglutinasi.
Abb. 10. Moderne Schematische Darstellung und Foto der Antigen-Antikorper-Reaktion nach Zugabe von Antihumanglobulin serum
Abb. 8. Schematische Darstellung eines IgG-Anti-korpermolekuls

Pemeriksaan serologi menggunakan berbagai macam reagen AHG yang reaktif dengan berbagai macam human glob, misal anti–IgG, Ab terhadap komplemen C3d. reagen AHG polysp ® anti – IgG dan anti C3d.


Reagen AHG

Reag Polysp AHG

Digunakan untuk pemeriksaan uji cocok serasi rutin, skrining, identifikasi Ab, DCT. Polysp AHG mengandung Ab terhadap IgG manusia dan komplemen C3d dari komplemen manusia. Ab anti – complemen yang lain dalam polysp AHG, misal anti – C3b, anti – C4b, anti C4d.

Ab yang mempunyai arti klinis ® tipe IgG, fungsi AHG ® mendeteksi IgG dan distandarisasikan untuk mendeteksi macam-macam tipe IgG Ab.

Aktifitas anti – C3d ® komplemen yang sangat penting dalam pemeriksaan DCT untuk AIHA.

Macam-macam AHG :

1) Monospecifik AHG (rabbit dan murine monoclonal) tediri dari rabbit anti human IgG dan mouse monoclonal anti C3b dan anti C3d.
2) Polysp AHG (murine monoclonal) terdiri dari Ab yang disekresikan oleh 3 macam cell lines dari berbagai spesifikasi anti – IgG, anti C3b dan anti C3d.

Reag Anti – IgG

Reag AHG berlabel anti-IgG tidak mengandung anti–komplemen. Anti–IgG sebagian besar dipergunakan sebagai alternatif terhadap AHG pemeriksaan Ab dan uji cocok serasi.
Ada petugas lebih senang menggunakan monospes dengan komplemen yang melekat pada sdm akibat auto Ab yang reaktif pada suhu dingin ® secara klinis tidak berarti, misal anti-I.
Reag Monospes AHG

Ab monospes terhadap human glob dibuat dengan menyuntikkan binatang dengan ummuno reagents seperti, IgG, IgA, IgM, C3 / C4. Serum membutuhkan adsorpsi untuk menghilangkan Ab yang tidak diinginkan dan memastikan kemurnian reag monospes tersebut.

Reag monospes AHG ® menentukan Ab yang memberikan hasil pos pada pemeriksaan DAT dengan polyspes AHG.

Anti–IgG (heavy chains) dan anti–C3d digunakan pada pemeriksaan IAT ® membedakan gambaran reaktivitas yang dihasilkan bila serum mengandung Ab dengan complemen binding / non complemen binding, seperti anti–Le (a) dan anti–E.

5. Sedimen sel tambahkan 2 tetes CS, putar 1000 rpm 1 menit. Baca hasil reaksinya.

Faktor Yang Mempengaruhi Sensitivitas IAT

Faktor yang mempengaruhi perlekatan Ab pada sdm invitro :

1. Temperatur
- Sdm dan serum diinkubasi pada suhi 370 C. Ab yang menyelubungi sdm yang klinis sangat berarti bereaksi secara optimal pada temperatur 370 C.
- Inkubasi temperatur lebih rendah dari 370 C mengurangi kecepatan assosiasi Ag dan Ab.
- Inkubasi diatas 370 C dapat merusak sdm / molekul Ab.

2. Ionic Strength
Sdm dapat disuspensikan kedalam berbagai media misal dalam lar saline fisiologis, lar albumin, LISS dan reag additive seperti polyethylene glycol (PEG)/hexadimethrine bromide (polybrene).

Dalam cairan isotonik, Na ion dan Cl ion bergerombol sekeliling sel dan sebagian menetralisir muatan yang berseberangan pada Ag dan molekul Ab. Effek penyelubungan ini yang merintangi assosiasi Ab dengan Ag dan dapat dikurangi dengan cara mengurangi ionic strength dari media reaksi.

Konsekuensi menurunkan konsentrasi garam dari media reaksi ® meningkatkan Ab yang melekat pada sdm. Penggunaan albumin kec bila digunakan dibawah kondisi ion yang rendah juga dapat melakukan perlekatan molekul Ab.



3. Proporsi Serum Terhadap Sel
Meningkatkan perbandingan serum dengan sdm dapat meningkatkan derajat Ab yang menyelimuti sdm. Perbandingan yang umum ® 2 tts serum terhadap 1 tetes suspensi sdm 2 – 5 %. Alternatif mengurangi suspensi sdm dari 5 % ® 2 – 3 % dapat melipat gandakan perbandingan serum terhadap sel.

Dengan meningkatkan ratio serum terhadap sel dapat mendeteksi Ab yang bereaksi lemah yang tidak terdeteksi dibawah suspensi normal sdm.

4. Waktu Inkubasi
Tehnik albumin waktu inkubasi 15 – 30 menit suhu 370 C ® waktu yang adekwat untuk mendeteksi Ab yang menyelimuti sdm yang secara klinis berarti. Ab yang bereaksi lemah, reaksi Ag Ab tidak dapat mencapai keseimbangan dalam waktu inkubasi selama 30 menit dan dengan memperpanjang waktu inkubasi dapat membuktikan keberadaannya.

Sumber Kesalahan

Hasil False Neg pada DAT dan IAT

1. Tidak mencuci sdm dengan bersih dan baik ® hasil pemeriksaan false neg, karena glob yang bebas yang tidak mengadakan ikatan dengan sel akan menetralisir AHG.
2. Reaksi false neg dapat terjadi ® pemeriksaan terganggu atau tertunda.
Pelaksanaan proses pencucian harus dilakukan secepat mungkin untuk mengurangi kehilangan Ab yang terlepas dari sel.
AHG harus ditambahkan segera setelah proses pencucian selesai ® Ab yang telah mengadakan ikatan akan terlepas kembali.
Setelah AHG ditambahkan harus segera diputar dan dibaca, karena reaksi IgG yang menyelimuti sdm akan melemah setelah inkubasi.
3. Reag kehilangan reaktivitas ® penyimpanan tidak baik, kontaminasi bakteri / serum manusia. Penyimpanan AHG dianjurkan pada 2 – 80 C, jangan dibekukan, bila warna berubah tidak digunakan lagi.
AHG mengalami netralisasi bila terkontaminasi dengan serum manusia / anti–D sera. Hal ini tidak terlihat dengan mata (makroskopis) tetapi terlihat bila diperiksa dengan CCC, hasil reaksi yang seharusnya pos menjadi neg.
4. Tidak ada AHG pada pemeriksaan, atau lupa menambahkan AHG. Hal ini dapat dicegah dengan memakai AHG yang berwarna.
5. Penggunaan centrifugasi yang tidak baik
Centrifugasi yang lambat keadaan menjadi tidak optimal untuk aglutinasi, sebaliknya centrifugasi yang terlalu kuat memadatkan sel, sehingga sel sukar untuk terurai.
6. Jumlah sdm yang ada pada pemeriksaan mempengaruhi reaktivitas. Reaksi yang lemah ® terlalu banyak sdm, sebaliknya sdm yang terlalu sedikit menyulitkan pembacaan aglutinasi dengan baik.
7. Reaksi prozone sebagai kemungkinan penyebab pemeriksaan antiglobulin tidak reaktif.


Hasil False Pos pada DAT dan IAT

1. Sdm sudah dicentrifugasi sebelum dilakukan pencucian. Apabila tidak terlihat ® aglutinasi yang tampak setelah penambahan AHG dapat disalah interpretasikan pembacaannya sebagai akibat perselubungan IgG / komplemen.
Sdm penderita cold react auto Ab yang kuat beraglutinasi pada contoh darah yang disimpan pada suhu kamar atau dibawah suhu kamar.
2. Tabulasi gelas yang tidak bersih terkontaminasi dengan debu, detergent / material lain yang menyebabkan sdm menggumpal / aggregasi.
3. Over centrifugation dapat memadatkan sdm ® aggregasi ® disalah artikan dengan aglutinasi.
4. Reag yang dibuat tidak baik dan dapat mengandung Ab yang mengakibatkan aglutinasi pada sel yang tidak diselubungi. Enzyme treated red blood cells dapat meningkatkan reaktivitas dengan antispecies Ab dan dapat bereaksi langsung dengan reag AHG yang mengandung kontaminasi aktivitas.

False Pos Pada DAT

1. Komponen komplemen C4 dapat melekat pada sdm ® menggunakan contoh darah beku yang berasal dari segmen dana dalam CPD – A1 yang disimpan 40 C / pada suhu kamar. Terjadi karena aktivitas cold auto Agglutinin alamiah yang sering terdapat pada serum normal mengakibatkan false pos pada AHG yang mengandung anti – komplemen.
2. False pos DAT dengan contoh darah yang diambil dalam tabulasi yang mengandung silicone gel.
3. Contoh darah yang diambil dari selang infus 5 % / 10 % dextrose dapat mengandung komplemen pada sdmnya.
4. Kontaminasi bakteri pada contoh darah dapat mengakibatkan DAT pos.

False Pos Pada IAT

DAT pos ® IAT pos untuk semua sera. Sdm yang diselubungi IgG sulit untuk diperiksa golongan darahnya ® menghilangkan IgG dari sdm dapat menggunakan heat treating atau chloroquine.